HLA分型技術(shù)
主要組織相容性復(fù)合物（MHC）是脊椎動(dòng)物體內(nèi)zui復(fù)雜且具有高度多態(tài)性的基因群。1984年George Snell 發(fā)現(xiàn)小鼠MHC即H－2，1958年Dausset 發(fā)現(xiàn)了人的MHC即HLA基因。MHC的表達(dá)產(chǎn)物稱(chēng)為主要組織相容性抗原，MHC抗原是有核細(xì)胞表面膜蛋白分子，對(duì)抗原遞呈和免疫信號(hào)傳遞起關(guān)鍵作用。
HLA基因，位于6號(hào)染色體上短臂上，長(zhǎng)約4000Kb。HLA是目前所知人體zui復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，有幾十個(gè)基因座位，每個(gè)基因座位又有幾十個(gè)等位基因，且呈共顯性表達(dá)。由于MHC基因位于同一條染色體上，其多基因座位上的基因型組合相對(duì)穩(wěn)定，很少發(fā)生同源染色體間交換，這就構(gòu)成了以單元型（HAPLOTYPE，即在同一條染色體上緊密連鎖的一系列等位基因的特殊組合）為特征的遺傳。按中國(guó)人常見(jiàn)的A座位基因有13個(gè)，B座位基因有30個(gè)計(jì)算，可組成的單元型約有13×30＝390種之多。理論上估計(jì)，父母各給一串單元型給子女，便會(huì)形成4.3萬(wàn)種HLA－AB血型。事實(shí)上，HLA 各基因并非*隨機(jī)地槌傻ピ停淺氏殖雋黃膠猓╨inkage disequilibrium,LD）的特點(diǎn)。理論推測(cè)的HLA 分型數(shù)量巨大，但對(duì)一個(gè)具體的民族來(lái)說(shuō)并非如此。世界上各個(gè)民族人群的HLA多態(tài)性和單元型都有各自的特點(diǎn)。總體來(lái)講，中國(guó)北方漢族、北美白人和北美黑人人群的多態(tài)性較中國(guó)南方漢族和日本人群豐富。即使在中國(guó)，地區(qū)間也存在差異。在中國(guó)漢族群體中抗原A1、A3、B13、B44和B51頻率呈北高南低分布，而抗原A24、B46、B60呈北低南高分布。在中國(guó)漢族群體中常見(jiàn)的A30-B13-DRB1*07，A1-B37-DRB1*10單體型頻率呈北高南低分布，在江浙滬漢族人群中頻率較北方漢族人群下降，而A2-B46-DRB1*09，A33-B58-DRB1*17，A33-B58- DRB1*13單體型頻率呈北低南高分布。HLA多態(tài)性程度可見(jiàn)一斑。
HLA研究涉及免疫學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科，并已發(fā)展成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科分支。迄今HLA研究已達(dá)到相當(dāng)深入的水平，并在諸多方面取得顯著進(jìn)展，包括HLA復(fù)合體結(jié)構(gòu)；HLA分子結(jié)構(gòu)及其表達(dá)的調(diào)控；HLA分子功能，尤其是在抗原處理、呈遞及T細(xì)胞識(shí)別中的作用；HLA的DNA分型及多態(tài)性研究；HLA與疾病的關(guān)系；HLA與移植的關(guān)系等。HLA研究不僅使器官移植成為一種極有價(jià)值的治療手段，并給基礎(chǔ)與臨床免疫帶來(lái)了突破性進(jìn)展。已經(jīng)證實(shí)，HLA復(fù)合體中存在控制免疫應(yīng)答的基因以及HLA參與約束免疫細(xì)胞間相互作用，這表示HLA涉及生命活動(dòng)的各個(gè)水平與多個(gè)方面。可以預(yù)期，對(duì)HLA的研究將繼續(xù)成為免疫遺傳學(xué)zui活躍的部分；對(duì)HLA的應(yīng)用將擴(kuò)展到基礎(chǔ)、臨床、預(yù)防醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。
縱觀HLA系統(tǒng)的研究過(guò)程，其發(fā)展無(wú)不與技術(shù)的手段的突破與運(yùn)用有密切關(guān)系。70年代到80年代末期主要是血清學(xué)研究；90年代以來(lái)，HLA進(jìn)入了分子水平研究階段，進(jìn)展尤為顯著。HLA分型技術(shù)同樣走過(guò)了這一歷程。建立于60年代并不斷*的血清學(xué)及細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)主要側(cè)重于分析HLA產(chǎn)物特異性。
血清學(xué)分型借助的是微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（microlymphocytotoxicitytest）或稱(chēng)補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒試驗(yàn)（complement dependent cytotoxicity test，CDC）。取已知HLA抗血清加入待測(cè)外周血淋巴細(xì)胞，作用后加入兔補(bǔ)體，充分作用后加入染料，，著染的細(xì)胞為死亡細(xì)胞，依據(jù)特異性抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)靶細(xì)胞溶解的原理，待檢淋巴細(xì)胞表面具有已知抗血清所針對(duì)的抗原。血清學(xué)分型存在諸多缺點(diǎn)：①標(biāo)準(zhǔn)分型抗體親和力較弱、效價(jià)較低、易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，②缺少某些單價(jià)抗血清；③某些病理過(guò)程可能導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞表面抗原性質(zhì)發(fā)生改變．干擾抗原—抗體反應(yīng)；④?chē)?guó)內(nèi)供HLA—I類(lèi)抗原分型的血清板來(lái)源困難、質(zhì)量欠佳。上述因素均嚴(yán)重影響了HLA分型結(jié)果的可靠性及該技術(shù)的推廣應(yīng)用。
細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)指的是通過(guò)純合分型細(xì)胞（homozygote typing cell,HTC）及預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)（primed lymphocyte test,PLT）對(duì)HLA分型。二種方法的基本原理均是判斷淋巴細(xì)胞在識(shí)別非己HLA抗原決定簇后發(fā)生的增殖反應(yīng)。由于分型細(xì)胞來(lái)源困難以及操作手續(xù)繁瑣，細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)下正逐漸淘汰。
1991年第11屆HLA專(zhuān)題討論上提出了HLA的DNA分型方法，這類(lèi)方法近年來(lái)在研究和應(yīng)用方面發(fā)展非常快，有取代其他方法的趨勢(shì)。DNA分型方法主要分為兩種：基于核酸序列識(shí)別的方法和基于序列分子構(gòu)型的方法。下面簡(jiǎn)要的闡述各方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)。
基于核酸序列識(shí)別的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。
PCR-RFLP：其原理是將目的基因片段PCR擴(kuò)增后，利用多種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，不同的基因序列會(huì)產(chǎn)生不同的酶切產(chǎn)物，從而產(chǎn)生不同的電泳圖譜。它以其簡(jiǎn)單、敏感、準(zhǔn)確，無(wú)需同位素等優(yōu)點(diǎn)成為目前較常用的HLA基因分型技術(shù)之一，但是無(wú)法分辨雜合子，且只能區(qū)分有限的多態(tài)性。
PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide）：也稱(chēng)PCR-ASO（allele specific oligonuCEOtide）。用以同位素或非放射性標(biāo)記的探針與PCR擴(kuò)增的目標(biāo)片斷產(chǎn)物雜交，根據(jù)陽(yáng)性斑點(diǎn)判斷個(gè)體基因型。由于HLA等位基因非常多，就需要很多的探針對(duì)每個(gè)DNA樣品要進(jìn)行多次雜交（甚至十幾次）才能完成定型分析操作也十分繁瑣。于是在此基礎(chǔ)上又發(fā)展起來(lái)一種反向雜交法（reverse hybridization）。將各種不同的探針固定于同一張膜上，再將PCR產(chǎn)物標(biāo)記，以PCR產(chǎn)物（待檢測(cè)基因DNA）反過(guò)來(lái)與探針雜交。這樣一次雜交即可完成多個(gè)等位基因分析。此方法具有靈敏度、特異性強(qiáng)、需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，但不同探針的雜交條件的須嚴(yán)格統(tǒng)一（如溫度，離子強(qiáng)度）, 易出現(xiàn)誤差;不能檢測(cè)新等位基因，試劑盒需不斷升級(jí); 對(duì)某些雜合子分辨率也不好;。很多HLA基因型含有相同的多態(tài)性，而僅僅由于排列方式不同，因此分辨率不及SSP和SBT（4.01＃113）。此方法適宜大量和高純度樣本，雜交條帶將作為書(shū)面原始記錄長(zhǎng)期保存（三種效果比較）。
PCR-SSP：上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，zui終均需用標(biāo)記的特性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，再分析結(jié)果。PCR/SSP方法用乃設(shè)計(jì)出一整套等位基因組特異性引物（sequence specific primer,SSP），借助PCR技術(shù)獲得HLA型別特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過(guò)電泳直接分析帶型決定HLA型別，從而大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行, 分辨率可從低到高, 成本低。缺點(diǎn)是不易自動(dòng)化;不能檢測(cè)新的等位基因，試劑盒需不斷升級(jí)。此方法適宜零散和純度低樣本，重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)要重提DNA和必須使用紫外凝膠成象儀保留原始資料，增加實(shí)驗(yàn)成本（三種效果比較）。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量試劑（引物）,且不能識(shí)別非經(jīng)典的HLA基因和假基因（綠）。針對(duì)HLA外顯子和內(nèi)含子序列精心設(shè)計(jì)引物可避免這些問(wèn)題。
PCR-SBT: 以PCR擴(kuò)增所要分析的基因片斷，然后對(duì)DNA序列進(jìn)行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大規(guī)模進(jìn)行，度高，能直接發(fā)現(xiàn)新的等位基因。但是由于雜合子的存在，無(wú)法分辨單元型。
以上各個(gè)方法都存在無(wú)法克服的缺陷，如能配合使用，則能大大提高分型能力。國(guó)外有學(xué)者對(duì)60個(gè)樣本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)單用SBT，只有18％的樣本能將A，B位點(diǎn)同時(shí)分型成功，如結(jié)合SSO，則能將所有樣本成功分型。
基于核酸序列識(shí)別的分型方法始終無(wú)法越過(guò)雜合子的難關(guān)。HSE（Haplotype-specific extention）技術(shù)地解決了這一問(wèn)題。它是利用磁珠與其中一條同源染色體的特異位點(diǎn)結(jié)合，達(dá)到分離同源染色體的目的，雜合子問(wèn)題不攻自破。因此，HSE無(wú)論與SSO還是SBT結(jié)合使用，都有*的效果（1.01＃12，4.01＃94）。
近年來(lái)，測(cè)序新技術(shù)發(fā)展層出不窮，紛紛運(yùn)用到HLA分型中。如E（multiplex single nucleaotide extention）,應(yīng)用鏈中止法原理，根據(jù)等位基因SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物和生物素?zé)晒鈽?biāo)記的ddNTP進(jìn)行分型，有重復(fù)性好，可分辨雜合子等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用到A位點(diǎn)的分型中。（4.01＃93）又如pyrosequencing 法分型，分辨率好，可分辨雜合子，自動(dòng)化程度也高。DNA芯片技術(shù)，作為一項(xiàng)檢測(cè)SNP的成熟技術(shù)，也已應(yīng)用到HLA 分型中.
基于序列分子構(gòu)型的分型方法在理論上就避開(kāi)了雜合子這個(gè)難題。SSCP（PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，PCR-single strand conformational polymorphism）是zui常用的根據(jù)構(gòu)型的分型方法。擴(kuò)增的目標(biāo)產(chǎn)物變形后形成單鏈，不同的序列，甚至僅有一個(gè)堿基的差異，就會(huì)形成不同的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而電泳速率不同。但此方法于分辨于200－300bp（綠16），且即使是同一單鏈DNA在相同情況下也會(huì)形成不同的構(gòu)型，使得電泳條帶很難分析;也有可能會(huì)出現(xiàn)當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對(duì)單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小的情況,使聚丙烯酰胺凝膠電泳無(wú)法分辨造成漏檢。
HA（異源二聚體電泳多態(tài)性，Heteroduplex Analysis）是另一種基于序列分子構(gòu)型的分型方法，根據(jù)異源二聚體未配對(duì)區(qū)域的長(zhǎng)度和分布而顯示出電泳條帶不同（綠18）。但與單鏈DNA相比，異源二聚體電泳條帶過(guò)于復(fù)雜，難以分析。
新發(fā)展的RSCA（Reference Strand Mediated Conformation Analysis）技術(shù)根據(jù)HA的原理，設(shè)計(jì)了位點(diǎn)特異性熒光標(biāo)記的參照DNA片段，與樣本DNA分子的正反鏈形成異源二聚體.帶有熒光標(biāo)記的電泳條帶易于分析，能夠克服HA的不足。
另外，提取基因組模板的技術(shù)也在不斷發(fā)展。用于分型的DNA來(lái)源也已不局限于血液，口腔涂片、唾液中提取的DNA也有相似的效果（7.01＃261）。針對(duì)微量基因組模板的情況，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出基于滾環(huán)復(fù)制的全基因組擴(kuò)增技術(shù)，可以將1ng的模板擴(kuò)大至100ng，足以應(yīng)付PCR-RFLP、PCR-SBT等分型技術(shù)的要求。
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