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PCR的基本反應步驟
  • 發布日期:2025-12-23      瀏覽次數:290
    • 聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA(或RNA)片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的特點,是能將微量的DNA大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的DNA,就能用PCR加以放大,進行比對。這也是“微量證據"的威力之所在。

      1、引物的設計:

      引物需要自己查找文獻或者自己設計,然后交給合適的生物公司來幫我們合成,合成引物,每管裝1OD。拿到引物后需要加水溶解,但是因為引物是看不見的,所以為了防止溶解過程中引物的丟失,拿到引物后先高速離心(10000rpm, 4°C離心2min)再進行加水溶解(ddH2O)。

      水的體積按引物濃度稀釋100倍,溶解好的引物用小管分裝,每管裝50μl即可,分裝后放-20°C保存。

      2、制作模板:

      模板的制作可以直接借助試劑盒,一般情況下Trizol的試劑可以滿足需要,直接按照試劑盒提示來做就可以了。

      3、建立體系、上機:

      PCR需要用到的DNA聚合酶、buffer、dNTPs。而經常用的DNA聚合酶有Taq酶,買的同時會附送10×buffer(主要成分是KCl、Tris-HCl和MgCl2,有些還有(NH4)2SO4)。

      做PCR之前要提醒大家一點,不是所有的PCR都用同樣的反應體系的,也就是說PCR體系里用到的試劑除了10×Taq Buffer以外,其它其實都是需要摸條件的,但是按大多數情況來說,需要調整的并不多,可能需要調整的主要試劑是MgCl2(其實是要調整Mg2+的濃度);可能需要控制的條件主要是退火溫度。

      4、跑膠驗證:

      在電泳之前,需要進行凝膠的配制,凝膠液配制的過程并不復雜,先用天平稱取適量的瓊脂糖粉末,加入到一定體積的1×TAE(Tris、乙酸、EDTA)緩沖液中,微波爐加熱至沸騰,拿出來搖勻,幫助粉末溶解,反復沸騰多次直到粉末溶解。待溶液不燙手,將核酸染料加入溶液中搖勻,接著將溶液趁熱倒到做膠的凝膠板上,插上梳子(用來預留加樣孔),等半小時左右膠凝固拔下梳子,連膠帶板一起放到電泳槽中,加電泳液至淹沒整塊凝膠(電泳槽中的電泳液也用1×TAE緩沖液)。

      然后將loading buffer與樣品混合,加入到凝膠小空(“梳子"形成的洞)中,DNA maker作為對照,同樣加入到篩孔中,然后插上電源開始跑膠就可以了,凝膠上有顏色的有兩條帶,等到前面的藍色帶跑到整塊膠的2/3處停止電泳(斷電),然后把膠拿出來,放到紫外光下觀察條。

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